λ噬菌體基因組DNA快速提取試劑he（離心柱型）

λ噬菌體基因組DNA快速提取試劑he 核酸提取

目錄號(hào)：40212

適用范圍：

適用于快速λ噬菌體DNA

試劑盒組成、儲(chǔ)存、穩(wěn)定性：

本試劑盒在室溫儲(chǔ)存12個(gè)月不影響使用效果。

儲(chǔ)存事項(xiàng):

1.   在RNase A管和DNase I管分別加入1毫升的裂解緩沖液吹打，顛倒混勻，充分溶解RNase A和DNase I后，   按照每次使用量分裝－20℃凍存，有效期6個(gè)月。

2.   結(jié)合液LB低溫時(shí)可能出現(xiàn)析出和沉淀，可以在37℃水浴幾分鐘幫助重新溶解，恢復(fù)澄清透明后冷卻到室溫即可使用。

3.   避免試劑長(zhǎng)時(shí)間暴露于空氣中產(chǎn)生揮發(fā)、氧化、pH值變化，各溶液使用后應(yīng)及時(shí)蓋緊蓋子。

具體產(chǎn)品的參數(shù)以收到產(chǎn)品說明書的參數(shù)為準(zhǔn)

產(chǎn)品介紹：

λ噬菌體載體廣泛用于文庫(kù)篩選，目的克隆培養(yǎng)獲得大量的噬菌體顆粒需要提取λ噬菌體DNA來開展測(cè)序等后續(xù)工作。λ噬菌體裂解培養(yǎng)物離心后的上清，首先用RNase A /DNase I混合mei消化去除殘留的宿主菌DNA/RNA，沉淀收集噬菌體，噬菌體被SDS裂解，殘留碎片通過沉淀離心去除掉。裂解物上清中的λ噬菌體DNA在高離序鹽狀態(tài)下選擇性吸附于離心柱內(nèi)硅基質(zhì)膜，再通過一系列快速的漂洗－離心的步驟，將鹽、細(xì)胞代謝物、蛋白等雜質(zhì)去除，zui后低鹽的洗脫緩沖液將λ噬菌體DNA從硅基質(zhì)膜上洗脫。

產(chǎn)品特點(diǎn)：

1.        不需要使用有毒的苯fen等試劑，也不需要乙chun沉淀等步驟。

2.        節(jié)省時(shí)間，簡(jiǎn)捷，可用于液體培養(yǎng)裂解物和固體培養(yǎng)板的提取，單個(gè)樣品操作一般可在1.5小時(shí)內(nèi)完成。

3.        產(chǎn)量高，典型的產(chǎn)量10ml λ噬菌體裂解培養(yǎng)物上清可以提取約10µg λ噬菌體DNA。

4.        多次柱漂洗確保高純度，OD260/OD280典型的比值達(dá)1.7～1.9。可以直接用來mei切和測(cè)序。

 注意事項(xiàng)：

1.        使用轉(zhuǎn)速可以達(dá)到13,000rpm的冷凍離心機(jī)。

2.        開始實(shí)驗(yàn)前將需要的水浴先預(yù)熱到37℃?zhèn)溆谩?/span>

3.        需要自備lv仿，20％SDS。

結(jié)合液LB含有刺激性化合物，操作時(shí)要戴乳膠手套，避免沾染皮膚，眼睛和衣

4.        服。若沾染皮膚、眼睛時(shí)，要用大量清水或者生理鹽水沖洗。

操作步驟：（實(shí)驗(yàn)前請(qǐng)先閱讀注意事項(xiàng)）

以10 ml噬菌體感染細(xì)菌培養(yǎng)上清提取舉例：

提示：

e  第一次使用前請(qǐng)先在漂洗液WB中加入zhi定量無水乙chun，充分混勻，加入后請(qǐng)及時(shí)在方框打鉤標(biāo)記已加入乙chun，以免多次加入!

e  將噬菌體沉淀液放在冰上預(yù)冷。

1.        將0.5%lv仿處理后的λ噬菌體感染的液體培養(yǎng)物10,000g（約12,000rpm） 4℃離心10分鐘去除細(xì)胞碎片和殘?jiān)?

轉(zhuǎn)速不能過高，時(shí)間不能過長(zhǎng)，否則噬菌體可能和碎片一起沉淀，降低產(chǎn)量。

2.        取10ml上清，加入20μl RNase和20μl DNase充分混勻37℃溫育30分鐘。

每個(gè)噬菌體培養(yǎng)上清因生長(zhǎng)和裂解情況不同而殘留RNA/DNA量不等。RNase/DNase消化過頭，可能減少產(chǎn)量；消化不wan全，可能未消化的DNA/RNA和細(xì)胞碎片粘去部分噬菌體減低產(chǎn)量并/或者導(dǎo)致zui后污染宿主菌DNA，因此應(yīng)該根據(jù)實(shí)際情況適當(dāng)調(diào)節(jié)用量和消化時(shí)間。

3.        加入2 ml 冰預(yù)冷的噬菌體沉淀液，輕柔充分混勻后置冰上冷卻（培養(yǎng)板裂解物必須在冰上放置30分鐘）。

4.        10,000g（12,000rpm）4℃離心10分鐘，棄上清，干燥1分鐘。沉淀下來的噬菌體外觀為透亮或者稍白的沉淀。

5.        加入500μl裂解緩沖液，吹打重懸噬菌體，加入100μl 20％SDS，立即輕柔顛倒混勻4-6次后，70℃溫育10分鐘，然后置冰上冷卻。

6.        加入100μl雜質(zhì)沉淀液，立即輕柔顛倒混勻4-6次，zui高速13,000g 4℃離心10分鐘。

7.        仔細(xì)將上清轉(zhuǎn)入新的離心管，加入350μl結(jié)合液LB，輕柔渦旋混勻。

8.        將上述混合物加入一個(gè)吸附柱AC中，（吸附柱放入收集管中）12,000rpm離心30秒，倒掉收集管中的廢液。

吸附柱一次zui多只可以容納大約700μl混合物，因此需要分次把混合物上到吸附柱內(nèi)，重復(fù)步驟8。

9.        加入700μl漂洗液WB（請(qǐng)先檢查是否已加入無水乙chun!），12,000rpm 離心30秒，棄廢液。

10.     可選步驟：重復(fù)步驟9一遍。

11.     將吸附柱AC放回空收集管中，13,000rpm離心2分鐘，盡量除去漂洗液， 以免漂洗液中殘留乙chun抑制下游反應(yīng)。

12.     取出吸附柱AC，放入一個(gè)干凈的離心管中，在吸附膜的中間部位加100μl洗脫緩沖液EB（洗脫緩沖液事先在 50℃水浴中預(yù)熱）， 室溫放置1分鐘，12,000rpm 離心1分鐘。如果想得到較多量的DNA，可將得到的溶液重新加入離心吸附柱中，12,000rpm離心1分鐘。

洗脫體積越大，洗脫效率越高，如果需要DNA濃度較高，可以適當(dāng)減少洗脫體積， 但是zui小體積不應(yīng)少于40μl，體積過小降低DNA洗脫效率，減少DNA產(chǎn)量。

13.     DNA可以存放在2-8℃，如果要長(zhǎng)時(shí)間存放，可以放置在-20℃。

v  問題與解決方法:

λ噬菌體基因組DNA快速提取試劑he 核酸提取